p53 Specifically Binds Triplex DNA In Vitro and in Cells

DNA tvořící triplexy se účastní řady biologických aktivit, včetně regulace genové exprese a genové nestabilitě vedoucí k rakovině. Protein p53 potlačující rakovinu je ústředním regulátorem buněčného cyklu s ohledem na různé typy poruch. Klíčovým atributem proteinu p53 je schopnost rozeznat specifické sekvenční a strukturní vzory v DNA. Tato práce je zaměřena na schopnost p53 vázat se na strukturně specifické vzory DNA obsahující triplexy in vitro a v buňkách, včetně vlivu na transkripci. Toto je první studie, která se zaměřuje na p53 a jeho varianty s ohledem na schopnost vázat se na obojí intra i inter-molekulární T.A.T triplexy. Ukazujeme, že interakce p53 s intermolekulárními T.A.T triplexy je srovnatelná se schopností rozpoznat CTG non-B DNA struktury. S využitím mutantů jsme  na p53 C-konci identifikoval doménu zodpovědnou za rozpoznání triplexu. Dále, silná schopnost p53 rozpoznávat intramolekulární T.A.T triplexy (H-DNA), stabilizované negativní superhelicitou v DNA plazmidu, byla detekována srovnávacími a immunoprecipitačními experimenty a vizualizována s AFM. Dále, chromatinová immunoprecipitace odhalila schopnost p53 vázat se na T.A.T triplexy in vivo. Rozšířená transaktivace s p53 na vložení triplexové sekvence do plazmidu s p53 konsensus sekvencí bylo pozorováno na základě vyhodnocení luciferase reporteru. Bioinformatická analýza lidských regulačních oblastí na současný výskyt jak konsensus sekvence, tak i T.A.T motivu, identifikovala množinu kandidátních p53 cílových genů a p53 závislá aktivace několika z nich (ABCG5, ENOX1, INSR, MCC, NFAT5) byla potvrzena skrze RT-qPCR. Naše výsledky ukazují, že T.A.T. triplexy tvoří novou třídu vazebních míst vyhledávaných proteinem p53 v DNA strukturně závislém módu in vitro a v buňkách. Diskutován je i schopnost p53 se strukturně vázat na DNA s ohledem na regulaci transkripce.